实验设计中，一般会做三个生物学重复来确保结果的准确性，尤其在下游分析中。但有时会遇到没有生物学重复，而又需要进行差异分析的情况，这时一般建议考虑foldchange即可，因为根本无法进行T-test等统计学方法嘛。但是如果必须要算一个P值（个人觉得没啥必要。。。），那么不同组学有各自处理的方法（虽然并不是靠谱），比如NGS的转录组的一些软件会预估一个离散度做校正，而质谱的蛋白组则是用Significance A/B算法，这篇文章主要讲下Significance A/B是怎么来的 一般在网上搜Significance A/B是很难搜到相关信息的，因为这个是特定用于蛋白组学的一种统计学方法，而且现在来说用的也比较少了；那当初为何提出这分析方法，个人觉得可能是因为那时蛋白组学成本过高。以前一直只知道有这一分析方法，但是不知其原理，最近在搜索中无意发现一个帖子What statistical methods for ITRAQ with two biological replication?，其中提到一篇文章中有对Significance A/B的介绍
Significance A/B最先是发表于2008年Nature Biotechnology期刊上，MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification，这篇文章主要是介绍Maxquant这款用于蛋白组定量分析软件的，非常有名，而其附录中作者提到了如何通过protein ratio来计算显著性（P值），附录PDF
先明确下Significance A/B算法的理论基础，原文如下：
The assumption that the ratio distribution is normal in a case where no differential regulation takes place is reasonable, since the protein ratios are obtained as averages of many SILAC peptide ratios. In the limit of a large number of SILAC peptides per protein a normal distribution can be assumed due to the central limit theorem
我的理解是，作者认为由于protein ratio是根据每个protein下许多个peptide的ratio计算出来的，那么根据中心极限定理，这ratio被假定为符合正态分布是合理的
什么是中心极限定理，引用<白话统计>书中的解释（因为我觉得这个更加通俗一点）：
中心极限定理不是针对原始数据的，而是针对统计量的。它说的是：不管原始数据的分布是什么样的（可能是正态的，也可能是偏态的），从原始数据中多次抽样，得到多个样本，每个样本可以计算出一个相应的统计量（如均数），如果每个样本中的例数大于30，那么这些统计量（如均数）的分布接近正态分布；而不是说：一个样本中的原始数据的个数大于30，原始数据的分布接近正态
所以根据上述中心极限定理，作者认为一个protein的ratio值是根据N个peptide的ratio计算出的一个统计量，这里的protein可以被看做一次抽样，而N个peptide则被看作是一次抽样中的N个例数，因此所有protein的ratio的分布可以被假定为正态分布。（PS.虽然理论基础还是蛮合理的，但是其实真正应用时并不是均符合的，比如不是所有protein的peptide都大于30个，另外在一些情况下是直接使用protein的intensity value来计算ratio，而不是基于peptide，仅为个人观点。。）
那么Significance A/B是如何计算的呢，先简单的讲一下Significance A，而Significance B则类似
Significance A
从上述的理论基础可看出，作者假定ratio的分布是符合正态分布的，那么根据正态分布的公式，我们需要对个每个protein的ratio做些处理以及标准化
The base of the logarithm is irrelevant for our calculation，对每个ratio作log转换，至于log2还是log10都可以，不影响结果
To make a robust and asymmetrical estimate of the standard deviation of the main distribution we calculate the 15.87, 50, and 84.13 percentiles r-1, r0, and r1，为了估计一个健壮以及不对称的标准差，作者先计算了15.87，50，84.34三个百分位的值，然后根据下述公式做标准化获得一个Z值，其中
r1-r0和r0-r-1则是分布左右两边的标准差。因此当ratio值大于ro时，标准差则为r1-r0；而当ratio值小于ro时，标准差则为r0-r-1，具体公式如下图所示：
significance-z-value Under the null hypothesis of normal tails of the log ratio distribution the probability of obtaining a value this large or larger is，将ratio做标准化转化后，这时的Z值则符合标准正态分布了，那么其对应的概率计算则就变得很简单了，类似于标准的假设检验方法了，按照作者意思，计算在正态分布中大于Z值的概率（标准正态分布曲线下大于Z值的那部分面积），可以理解为假设检验中的单尾检验？具体公式如下，其实就是个标准正态分布的概率累计函数
significance-pvalue
Significance B
Significance B的计算过程类似于Significance A，或者说是改进版？
作者发现那些高丰度蛋白相比低丰度蛋白，其中未发生变化的蛋白的ratio分布更加集中，如下图所示，那么高丰度蛋白的ratio也就相对会更加显著
significance_plot 考虑到这个丰度对结果影响，作者在Significance A算法的基础上，将protein根据intensity分成N个bin，每个bin至少包含300个蛋白，最后对每个bin进行一遍Significance A计算，然后将结果整合在一起
代码实现
了解了上述的Significance A/B的计算过程，那么我们就可以用代码将其实现，下面我用R写了个函数来计算Significance A，而Significance B从上述可知，只要对protein分bin后再用Significance A计算即可（这里不重复展示了），输入为ratio向量
get_significance <- function(ratio){
ratio <- log2(as.numeric(ratio))
order_ratio <- ratio[order(ratio)]
quantiletmp <- quantile(order_ratio, c(0.1587,0.5,0.8413))
rl <- as.numeric(quantiletmp[1]) #对应公式中的r-1
rm <- as.numeric(quantiletmp[2]) #对应公式中的r0
rh <- as.numeric(quantiletmp[3]) #对应公式中的r1
p <- unlist(lapply(ratio, function(x){
if (x > rm){
z <- (x-rm)/(rh-rm)
pnorm(z,lower.tail = F)
}else{
z <- (rm-x)/(rm-rl)
pnorm(z,lower.tail = F)
}
}))
}接着用这个函数计算ratio值就可得对应的P值了
p <- get_significance(data)以上为个人的理解，具体可以看那篇文献哦
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