mRNA文库构建

RNA-seq测序方法

  1. 在测mRNA过程中,首先要去除rRNA。以人为例,在抽提的总RNA中,95%的RNA是rRNA,2%的RNA是mRNA,剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。

  2. rRNA整个人类当中是非常保守的,在各个组织器官中也是非常稳定的,因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。

  3. Illumina公司的Truseq RNA建库方法是应用最广泛的一种,真核普通转录组为例:

    • 首先以mRNA的Poly(A)(高等生物特有的)这个特点,让带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交,使mRNA和磁珠相结合在一起。
    • 接着回收磁珠,将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
    • 然后用镁离子溶液将洗脱下来的mRNA打成片段,被打断的mRNA片段用随机引物逆转录出第一链的cDNA,再合成出第二链,这样就有了双链cDNA。
    • 对双链cDNA末端修复,加A加接头。
    • 片段选择,PCR扩增、纯化(如果样本中存在污染物,则需要结合试剂盒进一步纯化)。

简介-持续更新

写博客的目的 2019-03-24

首先我并不是正统学生信出身,因此我没有经历过完整的学习过程。
读研学了3年生物,在毕业前半年突然发现自己如果继续按照找生物公司-做实验-继续做实验这套路走下去的话,内心不知为何是抗拒的。比较幸运的是,那时接触到2代测序这个概念,就萌发了踏入生信这个领域。

从完全不懂到略微了解生信是干什么的,大约花了半年时间。期间除了工作上的知识以及技术外,还不断的学习了生信的一些相关技能。最初我是将所有知识点记在本子上,然后发现这样效率太低了。 然后我将学习的内容和保存在电脑上,这样只要有需要就可以随时在电脑上翻到以前别人总结的或者自己总结的知识。

但当有一天为了查一个问题的解法,从百度到google查了一天无果,那时真希望有个人能将这个问题放在了网上。而且一般来说,百度搜不到的问题都能在google上搜到,对于这一点,我还是蛮佩服老外的分享能力。因此在之前的一段时间内,我在想,我也将我自己的所整理的笔记分享到网上,能让一些想获取类似问题解答方法的人能够获得启发。

所以在生信领域来说,这博客所写的内容可能并不系统,深度由于自身原因可能也是比较浅。可能还会有些随意的笔记。我只能尽可能的写一些自己的经验,或许能帮上一些像我一样刚刚进入生信的初学者。

分享经验,从我做起~

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